بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac

فصل دوم

هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L₇/L₁₂ و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تکثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.

1- لکون نمودن ژنهای فوق در یک ناقل انتقال دهنده Cleaning vector

2- تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L₇/L₁₂

3- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریونی Procaryotic expression vector

4- تولید و تخلیص پروتئینهای L₇/L₁₂ و P39

5- کلون نمودن آنها در پلاسمید بیان کننده اوکاریوتی Eucaryotic expression vector

6- هاری کردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوکسین

7- تزریق پلاسمیدها، بسویه واکنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C

8- سنجشهای ایمونولوژیک

باکتریها و پلاسمیدهایی که برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند:

باکتریها: بروسلاآبورتوس سویه های 19S و 544 اشدیشیالکی سویه

اشریشیالکی سویه BL21 – اشریشیاکی سویه BL21(DE3(Plyss

پلاسمیرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) - Pblue Script-PCDNA3

- جداسازی کروموزوم بروسلا آبورتوس 19S:

برای تکثیر ج داسازی ژنهای L₇/L₁₂ و P39 ابتدا کروموزوم باکتری جداسازی گردید.

مواد:

بافر TE:

Tris – Hel 10mm

EDTA 1.0mm

‍PH بافر را پس از تهیه برروی 8 تنظیم می نمائیم.

پروتئیناز K:

CTAB/NaCl:

Nacl 4.1gr

CTAB 10gr

DDW 100ml (Final Volume)

روش:

ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه 19S تلقیح می نمائیم. پس 48 تا 72 ساعت باکتریها رشد کرده و کدورت مناسبی را پیدا می کند. بقیه مراحل تخلیص کروموزوم بشرح زیر است:

1- 5/1 میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت 2 دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را دور می ریزیم.

2- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باکتری اضافه کرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت یکساعت در دمای ⁰C37 نگهداری می نمائیم.

3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بمیزان Ml80 اضافه کرده و بمدت 10 دققیق در ⁰C65 انکوبه می کنیم.

4- هم حجم مخلوط بالا از ترکیب کلروفرم – ایزوآمیل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می کنیم. محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.

5- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل – کلروفرم – ایزوآمیل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ کرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.

6- هم حجم محلول روئی ایزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط می کنیم. پس از چند دقیقه DNA کروموزومی ته نشین شده که می توان بات یک پیپت پاستور آنرا جمع آوری نمائیم.

7- رسوب DNA کروموزومی را با الکل 70% شستشو داده و پس از خشک شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل می نمائیم.

بررسی کمی و کیفی DNA کروموزومی:

برای تعیین خلوط کروموزوم باکتری از مواد و وسایل زیر استفاده میشود.

1- بافر PBE pH=8(10X)

Tris – base 890mM

Boric Acid 890mM

EDTA 25mM

2- آگارز MP

3- تانک الکتروفورز افقی

روش:

ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.5x) را بکمک حرارت حل کرده و ژل آگارز افقی را سینی مخصوص تانک الکتروفورز افقی تهیه می نمائیم. سپس به مقدار Ml5 از DNA کروموزومی را در چلهک ژل ساخته شده ریخته و در تانک الکتروفورز حاوی بافر TBE(0.5x) پس از برقراری جریان الکتریکی مستقیم الکتروفورز می کنیم.

بریا تعیین مقدار DNA نیز پس از تهیه رقت تز کروموزوم DD آنرا در (Optimal Density) طول موج 260 نانومتر اندازه گیری می نمائیم. مقدار DNA بر اساس فرمول:عکس رقت 50 DD قرائت شده = مقدار DNA تعیین می گردد.

- مرحله پس از جداسازی کروموزوم تکثیر و جداسازی ژنهای مورد نظر است. این فرآیند با استفاده از دستگاه PCR انجام می گردد. در دستگاه PCR با استفاده از عوامل پایه ای، ژن مورد نظر را می توان با استفاده از آنزیم تک پلی مرآز Tag Polymerase تکثیر نمود. عوامل پایه ای ذکر شده شامل موارد ذیل است.

1- قالب

2- پرایمر جلو Forward

3- پرایمر عقب Revers

4- دروکسی نوکلئوتیدها LNTP

5- منیزیوم

6- بافر

7- آنزیم پلی مرآز

8- آب مقطر استریل

برای تهیه پرایمرها ابتدا باید آنها را طراحی کرد. برای طراحی پرایمرهای ژن L₇/L₁₂ و P39 ابتدا مترادف نوکلئوتیدی ژنهای فوق را از مرکز اطلاعاتی NCBI بدست می آوریم.

accession No(L₇/L₁₂). L27819

accession No(P39). L35038

سپس بر این اساس و درنظر گرفتن نکات استاندارد طراحی پرایمر از جمله طول پرایمر، دمای اتصال G+C%، تولید پرایمر، تولید لوپ یا حلقه و ... ترادف پرایمرهای تعیین میگردد. در این مرحله از آنالیزهای کامپیوتری توسط برنامه Dlogo و Blast استفاده میگردد.

ترادف ژن مورد نظر و پرایمرهای Forward و Reverse برای جداسازی ژنهای فوق از باکتری بروسلا به شرح زیر است:

_1- پرایمرهای L₇/L₁₂

Forward:

5’ GGA AAT GCT GAT CTC GCA AA3’

Revers:

5’ CCA CTT GAG TTC AAC XTT GGC CA3’

2- پرایمرهای P39

Forward:

5’ GCC GGC GCC TGT TGC CAA 3’

Reverse:

5’ C CGC TTT TGC GGC TTC AA 3’

جهت سهولت مراحل کلونینگ و با توجه به محلهای ممکن برای کلون سازی در پلاسمیدهای حد واسط و پلاسمیدهای بیانی دو جایگاه آنزیمی BamHI و XhoI درابتدا و انتهای پرایمر طراحی شده است. پرایمرهای طراحی شده توسط شرکت MWG آلمان ساخته شد.

برای انجام PCR از دستگاه TECHNE(Cambridge) مدل BENIUS استفاده شده است. برای بهینه سازی تکثیر ژنهای ذکر شده غلظتهای مختلف یون منیزیم (از 5/1 تا 5/3 میلی مولار) و دماهای مختلف مناسب برای اتصال پرایمرها با DNA کروموزومی (66-63 درجه سانتیگراد) بکار رفته است.

- تائید ژنوم سنتز شده توسط PCR:

برای تایید صحت قطعه ژنوم بدست آمده از PCR از هضم آنزیمی ژنهای فوق استفاده می گردد. چنانچه از هضم آنزیمی ژن L₇/L₁₂ با آنزیمهای EC0RI و Hind III بترتیب قطعات (168+206) و (305+69) باید دیده شود و از هضم آنزیمی ژن P39 با آنزیمهای NEOL و Hind III بترتیب قطعات (136+560+709) و (553+652) باید دیده شود.

برای تایید نهایی صحت ژنهای تکثیر شده از نظر ماهیت و ترادف نوکلئوتیدی آنها، این ژنها ابتدا در ناقل pSK⁺ کلون گردید و سپس برای تعیین سکانس به شرکت مربوط ارسال گردید.

- کلونینگ ژنهای L₇/L₁₂ و P39 در کلونینگ pSK⁺:

برای کلونینگ ژنهای فوق ابتدا باید ژنها تحت اثر آنزیمهای BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسمیدی pSK نیز با آنزیمهای اخیر برش داده شود.

1- برش آنزیمی ژنهای L₇/L₁₂ و P39 با آنزیمهای BamHI و xhoI.

2- برش آنزیمی پلاسمید pSK با آنزیمهای BamHI و xhoI پلاسمید pSK در حدود kb96/2 وزن دارد. این پلاسمید دارای یک ناحیه تکثیری ColE1، یک ناحیه مقاومت به آمپی سیلین تحریک ناحیه f1 origin و یک ناحیه بنام multiple cloning site=MCS که جایگاه تعدادی از آنزیمهای تحدیدی را در خود دارد. برای تکثیز پلاسمید فوق از باکتری اشدیشیاکلی استفاده می گردد.

3- برای برش آنزیمی این پلاسمید ابتدا باکتری حاوی این پلاسمید را تکثیر میدهد. در ضمن تکثیر باکتری پلاسمید مورد نظر در باکتری همانندسازی کرده و تعداد آن افزایش می یابد. برای تکثیر باکتری از کشت آن در ml2 محیط LB حاوی ng/ml50 آنتی بیوتیک آمپی سیلین استفاده می شود. پس از 18 ساعت کشت مورد نظر کدورت مناسب را پیدا میکند. پس از آن پلاسمید از باکتری تخلیص میگردد.

مواد:

1- SET buffer:

Sucrose 50mM

EDTA 10mM

Tris-Hcl pH 8 15mM

2- بافر لیزکننده:

Lysis Buffer (1ml)

Na OH (2N) 100ml

SDS (10%) 100ml

DDW 800ml

3- استات پتاسیم 5 مولار با pH 4.2

Potassiun Acetate 5M for 100ml

KAC (4M) 60ml

Acetic Acid 11.5ml

DDW 28.5ml

روش:

ابتدا 5/1 میلی لیتر از کشت 18 ساعت باکتری را با استفاده از سانتریفوژ با دور rpm4000 بمدت 5 دقیقه رسوب میدهیم. سپس رسوب بدست آمده را در 100ml از SET buffer کاملاً حل کرده بمدت 5 دقیقه در حرارت اتاق قرار می دهیم. پس از مدت فوق ml200 از محلول لیز بافر تازه تهیه شده را در رسوب سوسپانسیون فوق ریخته، بخوبی مخلوط کرده و بمدت 2 دقیقه در یخ قرار میدهیم. سپی ml150 از محلول KAC بر نخلوط فوق ریخته پس از مخلوط نمودن مجدداً بمدت 5 دقیقه در یخ میگذاریم.

جهت تفکیک پروتئینهای آزادشده سلولی از DNA پلاسمید ml450 از ترکیب فنل-کلروفرم – ایزوآمیل الکل (1/24/25) بر سوسپانسیون حاوی باکتریهای لیز شده افزوده و بمدت 5 دقیقه با دور rpm10000 سناتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را در لوله دیگر ریخته و به آن یک میلی لیتر اتانل مطلق سرد می افزرائیم. سپس با استفاده از سانتریفوژ با دور rpm1000 بمدت 5 دقیقه DNA پلاسمیدی را رسوب میدهیم. DNA رسوب داده را با الکل 70% شستشو میدهیم. پس از خشک شدن رسوب در مجاورت هوا، در ml20 از بافر TE حل نموده و به آن ئم5 از آنزیم Rnase A(5mg/ml) برای حذف RNA موجود اضافه می کنیم و بمدت نیم ساعت در ⁰c37 قرار میدهیم. برای نگهداری پلاسمید از ⁰c20- استفاده میشود.

پس از تلخیص، پلاسمید از نظر کیفی و کمی سنجیده میشود. برای این منظور از روشی که قبلاً در مورد کروموزوم باکتری توضیح داده شد، استفاده میگردد.

- هضم آنزمی پلاسمید sPK:

پس از تعیین غلظت پلاسمیدهای خالص شده هضم آنزیمی آن با استفاده از آنزیمهای BamHI و xhoI صورت میگیرد.

pSK 5ml(10ng)

BamHI 1ml

xhoI 1ml

Baffer (y Lango) 2ml

DDW 21ml

Tota l 30ml

پس از مدت 2 ساعت انکوباسیون در دمای ⁰c37 برای اطمینان از غلظت و کیفیت نمونه هضم شده آنرا برروی ژل آگارز 8/0% بررسی می نمائیم.

- هضم آنزیمی ژنهای L₇/L₁₂ و P39:

ژنهای فوق را نیز نظیر پلامید pSK تحت اثر آنزیمهای BamHI و xhoI قرار می دهیم.

L₇/L₁₂ 10ml P39 10ml

BamHI 1ml BamHI 1ml

xhoI 1ml xhoI 1ml

Baffer 2ml Baffer 2ml

DDW 21 DDW 21

total 30 total 30

- اتصال ژنهای L₇/L₁₂ و P39 با پلاسمید (Ligation preparation) PSK برای اتصال قطعات ژنی با پلاسمید PSK از آنزیم T4 DNA Ligale استفاده می شود.

L₇/L₁₂ 10ml P39 10ml

PSK 2ml PSK 2ml

T4 DNA ligale 1ml T4DNA ligale 1ml

Baffer 1.5ml Baffer 1.5ml

DDW 0.5ml DDW 0.5ml

total 15ml total 15ml

مخلوط فوق را بمدت 16 ساعت در ⁰c14 قرار میدهیم.

- انتقال DNA نوترکیب به میزبان) E0ch (HHI

- برای انتقال DNA نوترکیب به سلولهای میزبان ) E0ch (HHI ابتدا باید سلولهای میزبانهای مورد نظر و آماده پذیرش DNA نوتکریب بنمائیم. Competent cell برای تهیه این سلولها از وش زیر استفاده می گردد.

مواد:

محیط SOB

SOB for 100ml

0.5% yeast extract

2% trypton

10mm Nacl

2.5mm Kcl

10mm Mgcl2

10mm MgSo4

پس از تنظیم pH برروی 7-7.2 تنظیم کرده و پس از آن اتوکلاو می کنیم.

بافر TFBI

TFBI (for 100ml)

KAC 30mm

MnCl₂.4H₂O 50mm

Kcl 100mm

Cacl₂.2H₂O 10mm

Glycerol 15ml

H₂O Complete to 100ml

PH را برروی 8/5 تنظیم کرده و پس از آن با اتوکلاو استریل می نمائیم.

بافر TFBII

TFB II (for 100ml)

MOPS 10mm

Cacl₂.2H₂O 75mm

KCL 10mm

Glycerol 15ml

H₂O Complete to 100ml

پس از مخلوط نمودن آنرا با اتوکلاو استریل می کنیم.

روش تهیه Competent Cell

100 میلی لیتر از محیط SOB را در یک ارلن یک لیتری تهیه کرده و اتوکلاو می نمائیم. به محیط فوق 1 میلی لیتر از کشت 18 ساعت
) E.col.(DH5را تلقیح می نمائیم. ارلن را برروی شبکه قرار داده و با دور rpm200 در دمای ⁰C37 قرار داده تا OD₅₅₀nm به حدود 5/0 برسد. ارلن محتوی باکتری را بمدت نیم ساعت در یخ قرار داده و پس از آن بندت 10 دقیقه در دمای ⁰C4 در rpm1800 سانتریفوژ می کنیم. برروی رسوب بدست آمده 20 /میلی لیتر بافر TFB I اضافه کرده و به آرامی رسوب را در بافر حل نموده و بمدت 10 دقیقه در یخ می گذاریم. سوسپانسیون فوق را بمدت 10 دقیقه در ⁰C4 با دور rpm1800 سانتریفوژ کرده و به رسوب بدست‌آمده 2 میلی لیتر بافر FTB II افزوده بمدت 15 دقیقه در یخ قرار می دهیم. پس از این مدت ml100 از سوسپانسیون باکتری را در ایندرف 5/1 ریخته و آنرا در ⁰C70 نگهداری می نمائیم.

ترانسفورماسیون

مواد لازم:

- سلولهای Competent

- پلاسمید DNA نوترکیبی

- محیط کشت مایع نوترین برات

- پلیت حاوی محیط کشت نوترین آگار به همراه آمپی سیلین

- گرمخانه ⁰C37

روش کار:

1- سلولهای Comptent باکتری ) E.coli.(DH5 را از ⁰C70- بیرون آورده روی یخ قرار می دهیم تا باز شود.

2- مقدار ml10 از مخلوط پلاسمید نوترکیب شده در مرحله قبل، را به سلولهای Competent می افزائیم.

3- نمونه فوق را بمدت 30 دقیقه در یخ قرار میدهیم.

4- پس از زمان فوق اپندرف حاوی نمونه را بلافاصله در گرمخانه ⁰C37 بمدت 5 دقیقه قرار میدهیم.

5- مجدداً نمونه ها را بمدت 2 دقیقه در یخ قرار میدهیم.

6- مقدار ml800 محیط کشت نوترین برات به نمونه فوق اضافه کرده و بمدت یکساعت در ⁰C37 انکوبه مب کنیم.

7- پس از انکوباسیون، سوسپانسیون فوق را به پلیتهای حاوی نوترین آگار (محتوی Ng/cl60 آمپی سیلین) منتقل کرده و پلیتها را 18 ساعت در گرمخانه ⁰C37 قرار می دهیم.

- غربالگری

باکتریهای رشد یافته پس از ترانسفورماسیون در محییط نوترین برات آنتی بیوتیک کشت داده و پس از حدود 18 ساعت که کدورت محیط مناسب شد، پلامیت آنها را تخلیص می کنیم. پلاسمیدهیا تخلیص شده را برروی ژل آگارز 1% بررسی می نمائیم. پلاسمیدهائی که حاوی ژن مورد نظر باشند، حرکت کنتری دارند لذا از سایر پلاسمیدهای فاقد ژن قابل شناسایی می باشند. پس از شناسایی این باکتریها با انجام PCR و هضم آنزیمی پلاسمید با آنزیمهای BamHI و xhoI مورد تایید قرار می گیرند بطوریکه در PCR قطعه مورد نظر دیده شود و در هضم آنزیمی از پلاسمید خارج شود.